Sviluppo della microglia

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 1224 (2022) Citare questo articolo

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Qui descriviamo i vettori virali adeno-associati (AAV) mirati alla microglia contenenti una regione promotrice putativa da 1,7 kb della molecola 1 dell'adattatore legante il calcio ionizzato specifico per microglia/macrofago (Iba1), insieme a siti target ripetuti di miRNA per microRNA (miR )-9 e miR-129-2-3p. La sequenza genomica da 1,7 kb a monte del codone di inizio nell'esone 1 del gene Iba1 (Aif1), funziona come promotore preferenziale della microglia nello striato e nel cervelletto. Inoltre, l'espressione ectopica del transgene nelle cellule non microgliali viene marcatamente soppressa aggiungendo due serie di siti bersaglio di miRNA ripetuti a 4 per miR-9 e miR-129-2-3p, che sono espressi esclusivamente in cellule non microgliali e AAV- mRNA derivati. I nostri vettori hanno trasdotto microglia ramificata in tessuti sani e microglia reattiva in topi trattati con lipopolisaccaridi e in un modello murino di malattia neurodegenerativa. Inoltre, l’imaging fluorescente dal vivo ha consentito il monitoraggio della motilità microgliale e della mobilizzazione intracellulare del Ca2+. Pertanto, i vettori AAV mirati alla microglia sono preziosi per studiare la fisiopatologia e le terapie microgliali, in particolare nello striato e nel cervelletto.

Le microglia, che sono cellule immunitarie che risiedono nel sistema nervoso centrale (SNC), sono note per svolgere funzioni di sorveglianza e di scavenging. Studi più recenti, tuttavia, hanno rivelato diverse funzioni della microglia nel sistema nervoso centrale, tra cui lo sviluppo del cervello1,2, il rimodellamento dei circuiti neuronali1,3 e la progressione delle malattie neurodegenerative4,5,6.

I recenti progressi tecnologici hanno consentito l’espressione virale di varie molecole funzionali etichettate con proteine ​​fluorescenti, come G-CaMP (sensore di calcio)7 e ArcLightning (sensore di tensione di membrana)8 per la registrazione ottica e diversi canali ionici sensibili alla luce per l’optogenetica9. In queste circostanze, i vettori virali che trasducono specificamente le cellule microgliali nel cervello in vivo sono potenti strumenti per esplorare la funzione e il comportamento delle microglia nell’ambiente cerebrale nativo. Inoltre, le microglia vengono chemioattratte verso i siti di lesione nel cervello;10,11,12 quindi, le microglia trasdotte possono essere sfruttate per fornire un prodotto genetico terapeutico al tessuto danneggiato.

Per fornire un transgene alla microglia in vivo, il gruppo di Jakobsson ha utilizzato vettori lentivirali con un promotore della fosfoglicerato chinasi (PGK) e quattro sequenze complementari ripetute di microRNA-9-bersaglio (miR-9.T)13. Poiché miR-9 era espresso in modo endogeno nelle cellule non microgliali ma non nella microglia, l'RNA messaggero del transgene (mRNA) contenente miR-9.T è stato assorbito esclusivamente nelle cellule non microgliali, portando all'espressione selettiva del transgene nella microglia. Pertanto, è stato dimostrato che oltre il 70% delle cellule trasdotte nello striato di ratto erano microglia13. Tuttavia, la commutazione del promotore PGK in un forte promotore del citomegalovirus (CMV) nella cassetta transgenica dei vettori lentivirali provoca una notevole perdita di espressione del transgene nei neuroni e negli astrociti14. Inoltre, studi rilevanti hanno dimostrato l'induzione di miR-9 nelle microglia dopo la loro attivazione15,16,17, suggerendo la possibile soppressione dell'espressione del transgene nelle microglia reattive.

Precedenti studi hanno messo alla prova la trasduzione della microglia utilizzando vettori del sierotipo 2, 5 e del capside mutante 6 del virus adeno-associato (AAV) comprendenti promotori specifici della microglia, come quelli di F4/80 e CD6818,19. Tuttavia hanno ottenuto solo un successo minore con un certo "bersaglio a singola microglia", probabilmente a causa della debole attività del promotore e della bassa capacità di legame dei capsidi dell'AAV alla microglia. Pertanto, per la trasduzione efficiente e selettiva della microglia, sono necessari un robusto promotore specifico della microglia e un capside AAV microglia-tropico. Tra i tipi di capside AAV naturalmente isolati, AAV1 e AAV9 nella corteccia cerebrale e AAV1 nello striato hanno causato un'elevata espressione del transgene nella microglia. Tuttavia, oltre alla microglia, AAV1 nello striato ha mostrato una preferenza anche per gli astrociti e i neuroni20.